분자유전학실험실 (단국대학교 분자생물학과)



 이성욱 ( 2016-04-21 20:56:19 , Hit : 1195
 바이오통신원 [바이오토픽] 이제는 염기편집 시대, Cas9를 변형하여 DNA 한 글자만 바꾼다.


생명과학  양병찬 (2016-04-21 09:47)




Cas9 효소를 변형하여, 유전자 전체를 파괴하지 않고 DNA 글자 하나만을 효과적으로 바꿈으로써, 점돌연변이를 교정하는 유전자편집 방법이 개발되었다. 개발자들은 이것을 유전자편집(gene editing)이 아니라, 염기편집(base editing)이라고 부른다.

과학자들은 CRISPR 시스템의 재설계에 심혈을 기울인 끝에, 특정 유전자에서 DNA 글자 하나(a single DNA letter)만을 효과적으로 바꿀 수 있게 되었다. 이는 유전자편집의 성공률을 향상시키는 것은 물론, 인간질병의 모델링을 향상시키고 치료방법을 개발하는 데 기여할 것으로 보인다.

과학자들은 CRISPR–Cas9라는 유전자편집 도구를 신속하게 받아들여(참고 1), 표적 유전자를 매우 쉽게 변형할 수 있게 되었다. 그러나 CRISPR–Cas9를 이용하여 유전자의 기능을 말소하기는 쉽지만, 그 유전자에서 DNA 글자 하나만을 교정하여 점돌연변이(point mutation)를 수리하기는 어려웠다.

"점돌연변이는 매우 중요하다. 왜냐하면, 인간의 질병과 관련된 돌연변이는 대다수가 점돌연변이인 것으로 알려져 있기 때문이다. 그러나 현행 유전체편집 방법으로 점돌연변이를 효과적으로 교정하기는 매우 힘들었다"라고 하버드 대학교의 데이비드 류 박사(화학생물학)는 말했다.

1. 탐색과 파괴(search and destroy)

Cas9는 gRNA(가이드 RNA)의 도움을 받아 유전체의 특정 부분을 겨냥할 수 있는 효소(유전자가위)다. 일단 gRNA와 일치하는 DNA 염기서열을 찾으면, Cas9는 그 지점에서 이중나선 두 가닥을 모두 절단한다. 그러면 세포는 절단된 DNA를 수리함으로써 반응하지만, 기술이 왠지 서툴러 종종 염기(DNA 글자)를 삽입하거나 삭제하는 경향이 있다. 그 결과 하나의 유전자가 기능을 상실하게 된다.

이때 과학자들은 DNA 주형(DNA template)을 제공함으로써 다른 형태의 수리를 촉진하여, 복구효소(repair enzyme)로 하여금 적절한 DNA 시퀀스를 절단된 부위에 삽입하게 한다. 그러나 이 방법의 성공률은 일반적으로 5% 미만이며, 때로는 그보다 훨씬 더 낮을 수도 있다. 그밖의 수리방법들도 엉성하기는 마찬가지다.

그래서 류 박사와 동료(알렉시스 코모 박사 포함)가 이끄는 연구진은 다른 방법을 강구하는 데 착수했다. 그것은 'DNA를 절단하지 않고 유전체를 편집하는 방법'이었다.

연구진은 Cas9 효소를 불능화함으로써 DNA를 더 이상 절단하지 못하게 했다. 그리고는 거기에 다른 효소(시토신을 우리딘으로 전환시키는 효소)를 붙였다. 이제 gRNA가 불능화된 Cas9를 표적으로 안내하면, 변형된 Cas9(modified Cas9)는 이중나선을 절단하는 대신 DNA 시퀀스를 바꾸게 될 것이다. 그런데 우리딘(U)은 DNA보다 RNA에서 발견되는 게 보통이며, 만약 U가 DNA에서 발견될 경우, 세포는 U를 티민(T)으로 착각하고 잘못 읽게 된다.

시험관 속에 고립된 DNA를 대상으로 실험해 보니, 변형된 Cas9는 약 44%의 성공률을 거뒀는데, 이것은 상당한 성과라고 할 수 있다. 연구진은 이상의 연구결과를 정리하여 《Nature》에 기고했다(참고 2). 그러나 세포를 대상으로 실험해 보니, 변형된 Cas9의 성공률은 고작 7.7%에 불과한 것으로 나타났다. 성공률이 이렇게 낮은 이유를 분석해 보니, 효소가 DNA 가닥 하나만을 바꾸는 바람에 다른 가닥과의 불일치(mismatch)가 발생하기 때문이었다. 세포가 불일치를 교정함으로써, 변형된 효소가 한 일을 취소한다는 게 문제였다.

2. 변화관리(change management)

연구진은 다른 단백질을 변형된 Cas9에 결합함으로써 U가 DNA에서 제거되는 것을 차단하고, 그밖의 조작을 몇 가지 더 가했다. 그 결과 탄생한 염기편집기(base editor)를 배양된 마우스 세포에 적용해 보니, 알츠하이머병과 관련된 돌연변이를 최대 75%의 확률로 교정하는 것으로 나타났다. 배양된 인간세포를 대상으로 실험해본 결과, 염기편집기는 암(癌)과 관련된 유전자를 최대 7.6%의 확률로 교정하는 것으로 나타났다. 그러나 표준 CRISPR-Cas9로는 그게 전혀 불가능했다.

류 박사에 의하면, C를 U로 바꿈으로서 교정할 수 있는 질병관련 돌연변이에는 수백 가지가 있다고 한다. 그러나 연구진은 염기편집의 범위를 다른 점돌연변이로 확대하는 한편, 이 방법을 동물을 대상으로 실험하는 방안을 강구하고 있다. 류 박사의 또 다른 희망은, 변형된 Cas9를 이용하여 인간의 질병관련 돌연변이를 보유한 동물모델을 쉽게 만드는 것이다. 그리고 궁극적인 희망은, 다년간의 테스트와 개선을 거쳐 변형된 Cas9로 인간의 질병을 치료하는 것이다.

한편, 효소를 변형하는 방법을 다른 효소에 적용하는 것도 가능할 것으로 보인다. 예컨대, 작년에 개발된 Cas9의 대안, 즉 Cpf1의 경우, 유전자에 시퀀스를 삽입하는 데 효과적인 것으로 입증된 바 있다(참고 3). 또한 4월 21일 《Nature》에 실린 두 건의 논문은 Cpf1의 작동방식에 대해 새로운 통찰력을 제시했다. 한 논문은 Cpf1이 gRNA에 결합할 때 형태가 바뀌는 과정을 설명했고(참고 4), 다른 논문은 Cpf1이 DNA와 RNA를 모두 절단할 수 있다고 설명했다(참고 5).

스탠퍼드 대학교의 스탠리 치 박사(생명공학)는 류 박사가 개발한 '변형된 Cas9'를 한번 실험해 보고 싶어 안달이 났다. "변형된 Cas9는 기존의 CRISPR보다 훨씬 더 간단할 것 같다. 기존의 방법은 DNA 주형을 삽입하는데, 그것은 붕괴되기 쉬운 데다가 간혹 세포에 독성을 끼치기도 한다. 변형된 Cas9는 주요 장벽을 회피함으로써, CRISPR의 적용범위를 확대할 수 있다"고 치 박사는 말했다.

※ 참고문헌
1. http://www.nature.com/news/crispr-the-disruptor-1.17673
2. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”, Nature http://dx.doi.org/10.1038/nature17946 (2016).
3. Zetsche, B. et al., “Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system”, Cell 163, 759–771 (2015); http://www.nature.com/news/alternative-crispr-system-could-improve-genome-editing-1.18432; 한글번역 http://blog.daum.net/biomarket/7625623
4. Dong, D. et al., “The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA”, Nature http://dx.doi.org/10.1038/nature17944 (2016).
5. Fonfara, I., Richter, H., Bratovič, M., Le Rhun, A. & Charpentier, E., “The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA”, Nature http://dx.doi.org/10.1038/nature17945 (2016).

※ 출처: Nature
(http://www.nature.com/news/gene-editing-hack-yields-pinpoint-precision-1.19773)









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