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I. RNA as Ribozyme

 

1982년과 1983년 미국의 체크 그룹과 알트만 그룹은 기존에 알려져 왔던 RNA의 기능적 개념을 되엎는 놀라운 결과를 발표했다. ‘Thetrahymena’ 라는 단세포 원생생물의 리보솜 RNA의 일부분과 bacteria의 transfer RNA을 가공하는데 관여하는 ‘RNase P’라는 효소의 일부분(RNA)이 놀랍게도 기존의 단백질만 갖고 있을 것이라고 믿어 왔던 효소의 특성을 보인다는 사실을 밝힌 것이다.

   
 
   
 

이와 같이 효소로 작용하는 RNA를 RNA (Ribonucleic Acid)와 효소(enzyme) 의 합성어로 ‘Ribozyme’이라 부른다. 이런 획기적인 발견 이후, 식물을 감염시키는 병원체와 인체의 델타 virus 등 다양한 생명체에서 Ribozyme 같은 효소 기능을 가진 RNA들이 속속 발견됐다. 일반적으로 Ribozyme은 마치 가위와 같이 특정 RNA 염기서열을 인식해 그 부위를 자르기도 하고 또한 이어 붙일 수 있는 기능을 갖고 있다.

Fig. 2. Science 9 October 1998 : Vol. 282. no. 5387, pp. 259 - 264

 

   
 
 
 
Fig. 4. RNA replacement via Tetrahymena group I-based Trans-splicing ribozyme. Mol.Ther. Vol12. p824
   
  이러한 기능을 가지고 있는 trans-splicing ribozyme을 이용하여, HCV IRES( internal ribosome entry site)을 target하여 특이적으로 새로운 RNA을 발현시킬 수 있는 ribozyme을 계발하였다. Hepatitis C virus (HCV)는 non-A, non-B hepatitis을 일으키는 주요한 원인으로, 세계인구의 17억 명이 감염 되어있다. HCV에 의하여 감염된 경우 liver cirrhosis(간경화)나 hepatocellular carcinoma을 일으킬 수 있다. 최근 이 질병에 대한 치료법으로 IFN-α(interferon-α)을 처리하고 있으나, 많은 환자에게 toxicity을 나타내고 있다. 그래서 본 실험실에서 계발하는 ribozyme은 IFN-α에서 나타나는 문제점 없이, HCV가 감염된 세포에만 선택적인 toxicity을 일으킬 수 있도록 고안되었다. 또, HCV virus는 mutation확률이 높아서 공통된 target을 찾기가 어렵다. 이런 문제점은 HCV의 RNA중 가장 conserve되어 있는 IRES을 IGS (internal guide sequence)가 인지하도록 만들어 해결하다. 이렇게 고안된 ribozyme의 3’ exon에 DT( diphtheria toxin A)을 달아서 human cell에 transfection 시킨 결과 HCV IRES RNA와 그것을 target하는 ribozyme이 있는 경우에만 viability가 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다. 이 결과는 trans-splicing ribozyme이 HCV가 감염된 세포 특이적으로 therapeutic gene을 생산하여 anti-HCV agent의 기능을 할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
 
 
Fig. 5. Schematic diagram of the HCV-IRES-specific
trans-splicing ribozyme.
Fig. 6. Selective inductin of cytotoxin by the specific ribozyme in HCV IRES-expressing Huh-7 cells.
   
   
  HCV IRES이외에도 p53 mutant나 hTERT RNA을 선택적으로 cleavage시키고 new gene을 발현할 수 있는 ribozyme을 계발하였다. p53의 mutation은 50%, hTERT RNA의 발현은 90%이상이 tumor상에서 나타나고 있다. 이러한 RNA을 특이적으로 선별할 수 있는 ribozyme은 cancer cell을 target-specific 하게 세포 사를 유도함을 우리 실험실에서 확인 하였다.(Mol.Ther. Vol.10 ,p365 / Mol.Ther. Vol.12 ,p824 ) 특히 hTERT-specific trans-splicing ribozyme은 mice tumor xenograft mode에서 암세포 특이적으로 종양의 크기을 감소시켜서 쥐의 생존율을 높이는 것을 발견하였다. 이것은 tetrahymena trans-splicing ribozyme에 대한 최초의 in vivo efficiency확인 실험이었다.
 
   
  이 외에도 우리 실험실에서는 trans-splicing ribozyme이 좀더 조직 특이적으로 조절될 수 있는 방법을 고안하고 있다.이를 위하여 ribozyme의 발현 조절을 조직 특이적인 promoter에 의하여 관리받을 수 있는 system을 구축하였다(Fig.7). 이러한 system은 hTERT-specific trans-splicing ribozyme에서 나타날 수 있는 문제점, 즉 high proliferation cells( stem cells,germ cells etc.)에서도 hTERT RNA양이 많이 존재하기 때문에, 이런 일반 세포에서도 세포사를 유도할수 있는 점을 계선할 수 있다.
 
  Fig.7. Tissue-specific schematic diagram